Kortsarz, Micaela V. (2021) Caracterización de la transferencia de magnetización para detectar proteínas GFP con imágenes no invasivas de resonancia magnética nuclear / Characterization of magnetization transfer to detect GFP proteins with nuclear magnetic resonance non-invasive images. Maestría en Ciencias Físicas, Universidad Nacional de Cuyo, Instituto Balseiro.
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Resumen en español
La identificación de biomarcadores específicos de tipos celulares o de enfermedades es de gran importancia para el desarrollo de nuevas tecnologías médicas que permitan su identificación de manera no invasiva. La proteína verde fluorescente (GFP) es ampliamente utilizada en sistemas biológicos ya que es una herramienta flexible para su expresión en tipos celulares precisos. Dicha proteína permite localizar de forma controlada zonas de interés anatómicas y funcionales en tejidos a través de microscopía óptica ex vivo. Sin embargo, su gran precisión es a costa de tener que ser observada a través de técnicas invasivas que sacrifican al animal de estudio. En esta tesis evaluamos la capacidad de detectar la GFP basándonos en sus propiedades químicas y físicas, permitiéndonos observarla de forma no invasiva por imágenes por resonancia magnética nuclear (MRI). Particularmente, implementamos y optimizamos la técnica de MRI llamada imágenes por transferencia de magnetización (MTI) para detectar la GFP en muestras in vitro y tejidos ex vivo. MTI es una técnica de MRI diseñada para observar las macromoléculas presentes en los tejidos de forma no invasiva. Tópicamente, las macromoléculas no pueden ser detectadas directamente mediante MRI usual, a causa de los cortos tiempos de vida media de la señal de MRI. En cambio, mediante MTI, es posible detectarlas indirectamente a través del medio líquido que las rodea. En MRI convencional las diferencias en el brillo de las imágenes vienen dadas, normalmente, por la cantidad de protones o por las diferencias en los tiempos de relajación. En contraste a esto, en el caso de MTI, la señal adquirida refleja el intercambio de protones entre las moléculas de agua y las macromoléculas. En este trabajo exploramos cuáles son los parámetros óptimos que nos permiten maximizar el contraste en MTI, inducido por la proteína GFP in vitro y ex vivo. Comparamos estos efectos con los inducidos por la proteína llamada albúmina de suero bovino (BSA). La albúmina es la principal proteína de la sangre y, a su vez, una de las más abundantes en el ser humano. Esto nos permitiría predecir la factibilidad para distinguir la señal inducida por la GFP de la inducida por otras macromoléculas que se hallan intrínsecamente presentes en tejidos. Observamos que los efectos de la GFP, reflejados en la señal, son significativamente mayores a los de la BSA. A partir de estos resultados muy prometedores, evaluamos la potencialidad de la técnica implementada para dos modelos ex vivo diferentes: cerebros de ratón inyectados con un virus que induce la expresión de GFP en la región del giro dentado del hipocampo y peces cebra con expresión de GFP en todo su cuerpo. Mediante experimentos de MTI y microscopia óptica determinamos que los ensayos realizados para detectar la proteína GFP en el giro dentado del hipocampo de cerebro de ratón no fueron exitosos. Esto se debió a problemas en el sitio de inyección y los reducidos niveles de expresión de la proteína GFP. Sin embargo, hemos podido determinar condiciones y protocolos de trabajo para repetir estas experiencias en un futuro cercano. Los ensayos con peces cebra transgénicos, los cuales expresan la proteína GFP de manera ubicua, demostraron la factibilidad de la técnica para detectar de manera estadísticamente significativa la proteína GFP. Estos ensayos nos permitieron estimar las regiones de interés mínimas para las cuales se puede diferenciar la presencia de la proteína GFP de animales control. Los resultados de este trabajo, en conjunto, nos permitieron comprender la variabilidad y capacidad intrínseca del método de detección. Esto es esencial para la planificación de futuros experimentos en función de la pregunta a responder. Los resultados evidencian que si bien es necesario aumentar la cantidad de muestras analizadas en el presente trabajo, se puede concluir que la técnica de MTI puede ser de gran utilidad para la detección de GFP en distintos modelos animales donde se registre una alta expresión de la proteína GFP o donde se puedan analizar grandes volúmenes de tejido (mayores a 0.2 mm"3). En particular, esta técnica sería de gran utilidad para el estudio de modelos animales de gran tamaño, como ser ratas y monos.
Resumen en inglés
The identification of specific biomarkers of cell types or diseases is of great importance for the development of new medical technologies that allow their identification in a non-invasive way. Green fluorescent protein (GFP) is widely used in biological systems as a flexible tool for its expression in precise cell types. This protein allows to locate in a controlled way areas of anatomical and functional interest in tissues through optical microscopy ex vivo. However, its great precision is at the expense of having to be observed through invasive techniques that sacrice the animal. In this thesis we evaluate feasibility to distinguish GFP based on its chemical and physical properties that allow us to observe it non-invasively by nuclear magnetic resonance imaging (MRI). Particularly, we implemented and optimized the MRI technique called magnetization transfer images (MTI) to detect GFP in in vitro samples and ex vivo tissues. MTI is an MRI technique designed to observe macromolecules present in tissues in a non-invasively way. Typically, macromolecules can not be detected directly by usual MRI due to the short half-life of the MRI signal. On the other hand, via MTI, it is possible to detect macromolecules indirectly through the liquid medium that surrounds them. In conventional MRI, the differences in the brightness of the images are usually given by the amount of protons or by the differences in the relaxation times. In contrast, the acquired MTI signal reflects the exchange of protons between water molecules and macromolecules. In this work we explore the optimal parameters that allow us to maximize the contrast in MTI, induced by the GFP protein in vitro and ex vivo. We compare these effects with those induced by the protein called bovine serum albumin (BSA). Albumin is the main protein in the blood and one of the most abundant in humans. This would allow us to predict the feasibility to distinguish the signal induced by GFP from that induced by other macromolecules that are intrinsically present in tissues. We observe that the effects of GFP, reflected in the signal, are signicantly greater than those of BSA. Based on these very promising results, we evaluate the potential of the implemented technique for two different ex vivo models: mouse brains injected with a virus that induces GFP expression in the dentate gyrus region of the hippocampus and zebrash with GFP expression all over its body. Through MTI experiments and microscopy we determined that the trials performed to detect GFP protein in the dentate gyrus of the mouse brain hippocampus were unsuccessful, due to injection site problems and reduced GFP protein expression levels. However, we have been able to determine working conditions and protocols in orden to repeat these experiences in the near future. Trials with transgenic zebrash, which ubiquitously express the GFP protein, demonstrated the feasibility of the technique to statistically detect the GFP protein. These tests allowed us to estimate the minimal regions of interest for which the presence of the GFP protein can be differentiated from control animals. The results of this work together allowed us to understand the variability and intrinsic capacity of the detection method. This is essential for planning future experiments based on the question to be answered. The results show that although it is necessary to increase the number of samples analyzed in this study, it can be concluded that the MTI technique can be very useful for the detection of GFP in different animal models where a high expression of the GFP protein is registered or where large volumes of tissue can be analyzed (greater than 0.2 mm3). In particular, this technique would be very useful for studying large animal models, such as rats and monkeys.
| Tipo de objeto: | Tesis (Maestría en Ciencias Físicas) |
|---|---|
| Palabras Clave: | Nuclear magnetic resonance; Resonancia magnética nuclear; [Nuclear magnetic resonance imaging; Imágenes resonancia magnética nuclear; Magnetization transfer; Transferencia de magnetización; Green fluorescent protein; Proteína verde fluorescente; Biomarkers; Biomarcadores] |
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| Materias: | Medicina > Física médica |
| Divisiones: | Gcia. de área de Investigación y aplicaciones no nucleares > Gcia. de Física > Física médica |
| Código ID: | 944 |
| Depositado Por: | Marisa G. Velazco Aldao |
| Depositado En: | 21 Jul 2021 10:00 |
| Última Modificación: | 21 Jul 2021 10:12 |
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